کاربردی ترین روش استخراج رنگدانه های اسپیرولینا

در قرن نهم، امپراتوری Kanem در چاد مزایای Arthrospira platensis را کشف کرده بود. امروزه، جلبک‌های سبز آبی از جنس Arthrospira، که به عنوان Spirulina شناخته می‌شوند، در سرتاسر جهان به‌خاطر خواص تغذیه‌ای‌ خود به صورت تجاری کشت داده می شوند و استفاده گسترده ای دارند. محبوبیت اسپیرولینا به عنوان مکمل غذایی عمدتاً به دلیل محتوای بالای پروتئین (تا حدود 70 درصد وزن خشک) و غنی بودن آن از مواد معدنی، ویتامین ها و پروویتامین ها، فیتوکمیکال ها، اسیدهای آمینه ضروری، فیبرها و رنگدانه ها است. همه این موارد موجب شده که تجاری سازی اسپیرولینا سال به سال با آگاهی مصرف کنندگان در مورد اهمیت عوامل طبیعی آن، افزایش می یابد.

مهمترین رنگدانه های موجود در جلبک اسپیرولینا:

جلبک اسپیرولینا حاوی رنگدانه های طبیعی متمایزی به رنگ های نارنجی، سبز و آبی است،که به ترتیب ناشی از کاروتنوئیدها، کلروفیل ها و فیکوسیانین ها هستند. استخراج پیگمنت ها از منابع طبیعی، درواقع یک استراتژی شناخته شده به دلیل محدودیت های قانونی در زمینه رنگ های مصنوعی است. به طور خاص، فیکوسیانین به دلیل ساختار مبتنی بر پروتئین و رنگ نادر آبی تند، به طور گسترده به عنوان یک رنگ خوراکی با ارزش در نظر گرفته شده است. در سال های اخیر استراتژی‌های مختلفی برای جداسازی و خالص‌سازی فیکوسیانین ایجاد شده است، اما اشکال اصلی چنین فرآیندهایی این است که کاروتنوئیدها و کلروفیل ها به طور کلی همراه با زیست توده باقیمانده هدر می روند. در صورتیکه روش هایی وجود دارد که یک زنجیره استخراج رنگدانه یکپارچه را پیشنهاد می‌کند و می توان با استفاده از این روش ها هر سه نوع رنگدانه کاروتنوئید، کلروفیل و فیکوسیانین را به صورت بهینه از اسپیرولینا استخراج کرد. 

بدنه این استراتژی شامل دو مرحله متوالی استخراج کاروتنوئیدها و کلروفیل ها، قبل از استخراج فیکوسیانین، با استفاده از CO2 فوق بحرانی (scCO2) با حداقل تغییرات در زیست توده است. سپس زیست توده که از نظر ترکیبات لیپوفیل و کلروفیل تخلیه شده است، آماده استخراج فیکوسیانین است. عدم وجود هر گونه مرحله حرارت دهی یا مخرب، امکان استفاده مجدد از زیست توده اسپیرولینای تیمار شده با scCO2 را برای مرحله استخراج بیشتر در محیط های آبی با هدف بدست آوردن فیکوسیانین فراهم می کند، و در نهایت یک استراتژی برای تولید رنگدانه آبی با خلوص بالا ایجاد شده است، که با توجه به مقیاس پذیری فرآیند کلی، از نظر هزینه و زمان مصرف، بسیار بهینه است. همچنین به منظور افزایش خلوص فیکوسیانین، مراحل متوالی از جمله انعقاد الکتریکی، دیالیز و نمک‌زدایی پروتئین ایجاد می شود و در واقع یک استراتژی بالقوه مقیاس پذیر برای به دست آوردن رنگدانه آبی با خلوص بالا است.

محتوای کاروتنوئیدها در جلبک اسپیرولینا:

کاروتنوئیدها رنگدانه های چربی دوست طبیعی هستند، که مسئول رنگ های قرمز، زرد و نارنجی موجود در بسیاری از موجودات زنده هستند. آنها به‌عنوان رنگ‌ها و طعم‌دهنده‌های خوراک انسان و دام و همچنین مکمل‌های غذایی محبوب هستند. اسپیرولینا در مقایسه با سایر منابع طبیعی محتوای بالایی از کاروتنوئیدها از جمله بتا کاروتن (β-carotene)، کریپتوکسانتین (cryptoxanthin) و زآگزانتین (zeaxanthin) دارد. درصد نسبی این رنگدانه ها ممکن است با رشد اسپیرولینا، شرایط محیطی، فرآوری و غیره متفاوت باشد.

در گذشته scCO2 با موفقیت برای جداسازی کاروتنوئیدها از ماتریس های میوه و سبزیجات مختلف استفاده شده است. این تکنیک قادر است عصاره های کاملاً عاری از حلال های آلی در دما و فشار بحرانی نسبتاً پایین ایجاد کند. از آنجایی که پارامترهای مختلف به طور بالقوه بر فرآیند استخراج scCO2 تأثیر می‌گذارند، بهینه‌سازی شرایط آزمایشی گامی حیاتی در توسعه این روش است. این روش نیاز به اضافه کردن هیچ اصلاح‌کننده آلی ندارد، زیرا scCO2 به تنهایی قدرت حل‌شوندگی مشابه n-هگزان را نشان می‌دهد، بنابراین می‌تواند ترکیبات چربی دوست مانند کاروتنوئیدها را حل کند.

محتوای کلروفیل در جلبک اسپیرولینا:

اسپیرولینا ممکن است حدودا به میزان 2 درصد وزن خود، کلروفیل داشته باشد، که این میزان ده برابر بیشتر از کلروفیل موجود در گیاهان معمولی است و از این رو باعث افزایش بازده تبدیل فتوسنتزی می‌شود؛ که در مقایسه با سایر گیاهان، حدود 8 تا 10 درصد بیشتر است. معمولاً کلروفیل a از مواد خام بر اساس استخراج با حلال استخراج می شود. اگرچه فرآیند معمولی استخراج به خوبی بررسی شده است، معایبی مانند دمای استخراج بالا، زمان استخراج طولانی، مقادیر زیاد حلال ها و بازدهی کم استخراج نیاز به تکنیک های جایگزین را به وجود آورده است. با این وجود، تنها تحقیقات کمی در مورد استخراج کلروفیل a با استفاده از scCO2 در دسترس است. برخی از مقالات، از یک حلال کمکی برای افزایش قدرت حل‌شوندگی سیال فوق بحرانی به سمت مولکول استفاده می‌کنند. زیست توده اسپیرولینا که کاروتنوئید آن استخراج شده است، با افزودن اتانول به‌عنوان یک حلال کمکی، تحت فرآیند استخراج scCO2 قرار می گیرد، تا بازده استخراج را به سمت ترکیبات قطبی بیشتر هدایت کند.

در بیشتر روش های قبلی استخراج، متانول به عنوان یک اصلاح کننده پیشنهاد شده است، در حالی که حلال هایی مانند متانول  در فرآیندهای صنعتی ممنوع هستند. CO2 فوق بحرانی به تنهایی قادر به استخراج انتخابی کاروتنوئیدها است، در حالی که افزودن یک حلال کمکی در شرایط عملیاتی یکسان، منحصراً کلروفیل های a و b را استخراج می کند. با تنظیم پارامترهای عملیاتی متوالی، این تکنیک قادر است ترکیبات ارزشمند را یک به یک بدون نیاز به مراحل تصفیه یا خالص سازی، از زیست توده استخراج کند. برای استخراج کاروتنوئید و کلروفیل، CO2 فوق بحرانی (scCO2)، به دلیل مزایای فوری آن نسبت به تکنیک‌های سنتی مبتنی بر حلال، بدون استفاده از حلال های آلی مضر بالقوه ترجیح داده می شود.

افزودن یک حلال کمکی (به عنوان مثال اتانول) در نسبت اختلاط نسبتاً کم با scCO2 می‌تواند قطبیت آن را اصلاح کند و امکان استخراج مولکول‌های قطبی بیشتری را فراهم کند. علاوه بر این، دمای عملیاتی به اندازه کافی پایین است تا از تخریب مواد حساس به حرارت جلوگیری شود. در نهایت، CO2 به راحتی در شرایط محیطی از جامد حذف می شود و/یا در مقیاس صنعتی می توان آن را از طریق یک دستگاه خاص برای استفاده مجدد تازه آن بازیابی کرد. تحقیقات جدید بر این باورند که این روش مزیت قابل توجهی نسبت به استخراج معمولی از نظر سهولت بازیابی، گزینش پذیری، پایداری ترکیبات، زمان و صرفه جویی کلی انرژی درد.

محتوای فیکوسانین در جلبک اسپیرولینا:

بر اساس مطالعات متعدد، فعالیت های آنتی اکسیدانی قوی اسپیرولینا و حذف رادیکال های آزاد عمدتاً به فایکوسیانین آبی رنگ نسبت داده می شود. استخراج، جداسازی و خالص‌سازی فیکوسیانین به دلیل ارزش تجاری آن، برای سال‌های متمادی مورد توجه بوده و منجر به ایجاد استراتژی‌های متنوعی شده است، که نتایج متفاوتی هم دارند. اما اشکال اصلی این فرآیندها منجر به دور ریختن محتوای رنگدانه های با ارزش افزوده باقیمانده، مانند کاروتنوئیدها و کلروفیل ها به عنوان زباله در پسماندهای زیست توده می شود.

واحدهای اساسی پروتئین فایکوسیانین زیر واحدهای α و β هستند، که در پروتومرهای (αβ) مرتب شده اند. این ساختارها به نوبه خود می توانند، به تریمرها (αβ )3 و هگزامرها (αβ)6 مرتبط شوند. به همین دلیل، وزن مولکولی فیکوسیانین بین 18 کیلو دالتون (با در نظر گرفتن واحدهای منفرد) و 210 کیلو دالتون (با در نظر گرفتن هگزامرها) است.

فرآیند دو مرحله‌ای scCO2، که ابتدا کاروتنوئیدها و سپس کلروفیل تولید می‌کند، می تواند محتوای فیکوسیانین زیست توده اسپیرولینا را بدون تغییر نگه دارد. در واقع، پودر آسیاب شده از رنگدانه های نارنجی و سبز خود محروم شده و بعد از scCO2 به رنگ آبی غنی می شود، عمدتاً به دلیل حذف کلروفیل ها، که مسئول ایجاد رنگ سبز معمولی آن هستند. شکل زیر پودر اسپیرولینا را قبل و بعد از مرحله استخراج scCO2 نشان می دهد.

زیست توده اسپیرولینا که پس از scCO2 بازیافت می شود، مجدداً برای استخراج فیکوسیانین با روش‌های آبی مورد استفاده قرار می گیرد. اولتراسوند به شدت سلول ها را مختل می کند، بنابراین عصاره های خالص کمتری به دست می دهد. روش انجماد و ذوب هیچ مزیتی در مقایسه با همزدن با آب ندارند و ساده تر و وقت گیرتر هستند. به نظر می‌رسد تغییرات pH نکته کلیدی باشد: هم زدن سوسپانسیون در محلول کلرید آمونیوم نه تنها عملکرد را افزایش می‌دهد (در مقایسه با محلول‌های قلیایی pH)، بلکه می‌تواند عصاره‌های خالص‌تری را نیز فراهم کند و به عنوان بهترین استراتژی استخراج شناخته شده است. کلرید آمونیوم یک محلول نمکی موثر و مناسب برای افزایش خلوص فیکوسیانین در عصاره‌های خام است. علاوه بر این، هزینه استخراج را کاهش می دهد، زیرا نسبت به سایر نمک ها ارزان تر است.

جداسازی مواد جامد معلق:

پس از استخراج رنگدانه ها، یکی از مقرون به صرفه ترین تکنیک ها در برداشت جلبک برای حذف بخش زیادی از بقایای جامد معلق، روش انعقاد الکتریکی است. در انعقاد الکتریکی، لخته سازی از طریق آزادسازی الکترولیتی یون های فلزی از یک آند القا می شود و از آلودگی آنیون ها جلوگیری می کند. هزینه عملیاتی چنین تکنیکی معمولاً پایین است. کلید اصلی این فناوری اعمال جریان بین یک آند (مثل آلومینیوم) و یک کاتد بی اثر (ساخته شده از آلومینیوم و همچنین آند) است. یون های آلومینیوم از آند آزاد می شوند و می توانند بار سطحی منفی جلبک را خنثی کنند. علاوه بر این، حباب‌های اکسیژن و هیدروژن نیز توسط جریان الکتریکی تولید می‌شوند، بنابراین آشفتگی را افزایش می‌دهند و به فرآیند لخته‌سازی کمک می‌کنند و اکثر قطعات سلولی را می‌توان به سادگی با فیلتر کردن روی گاز جدا کرد.

با این حال، انعقاد الکتریکی در حذف ذرات بسیار ریز باقی مانده از دیواره سلولی از محلول کامل نیست و بسته به کاربرد خاص رنگدانه، ممکن است فیلتراسیون بیشتری لازم باشد. روش هایی مانند اولترافیلتراسیون پرهزینه هستند و از این رو به سختی در مقیاس بزرگ قابل استفاده اند؛ اما فیلترهای کاغذی در واقع ارزان ترین مواد یکبار مصرف در تجارت هستند و در صورت گرفتگی به راحتی قابل تعویض هستند. اگرچه مقدار کمی از پیگمنت آبی در طی فرآیند فیلتراسیون به دلیل جذب روی غشاها از بین می رود، که قابل چشم پوشی است.

خالص سازی فیکوسیانین:

مراحل متوالی انجام شده برای دستیابی به فیکوسیانین با خلوص بالا موثر اما زمان بر هستند. با این آگاهی، سطوح مختلفی از خالص سازی پیشنهاد می شود، به طوری که هنگامی که خلوص برای برآوردن نیازهای یک برنامه خاص کافی باشد، می توان مراحل بعدی را حذف کرد. مرحله بعدی شامل خالص سازی پروتئین توسط غشای دیالیز است. دیالیز معمول نیست اما در مقایسه با سایر روش های خالص سازی از نظر صرفه جویی در هزینه، مزایای زیادی دارد.

استفاده از CO2 فوق بحرانی ذاتاً یک روشی برای صرفه جویی در زمان و در مقایسه با روش های استخراج سنتی با حلال های آلی انتخابی تر است. در این روش فیکوسیانین با محتوا و درجه خلوص متوسط تولید می شود، از این رو، این استراتژی استخراج برای کاربردهای در مقیاس بزرگتر پیشنهاد می شود

و منجر به حداکثر بازیابی با کمترین هزینه می گردد. البته بسته به نیاز به درجه خلوص عصاره فیکوسیانین، برای کاربردهای متفاوت، برخی از مراحل پیشنهادی را می توان حذف کرد که باعث صرفه جویی در زمان و هزینه انرژی می شود.

ارزش افزوده فرآیند ارائه شده در این کار ابتدا مربوط به استخراج اولیه رنگدانه های نارنجی و سبز است، که معمولاً در زیست توده دور ریخته شده تلف می شوند. علاوه بر این، فرآیند کلی، تولید فیکوسیانین درجه متوسط، تنها چند ساعت طول می کشد. قیمت فیکوسیانین در بازار اغلب با کیفیت آن(میزان خلوص و غلظت) تعیین می شود، که کاملا به مراحل استفاده شده در فرآیند استخراج بستگی دارد و قطعا به حداقل رساندن مراحل تولید به کاهش هزینه های فرآیند و افزایش بازده محصول کمک می کند. به عنوان مثال، انعقاد الکتریکی و دیالیز در حال حاضر به طور گسترده در صنعت استفاده می شود و به عنوان مراحل آسان برای انجام شناخته شده است. پس از استخراج فیکوسیانین، زیست توده دور ریخته شده، که فقط حاوی بقایای گیاهی و نمک است، دیگر محتوای ارزش افزوده ای ندارد.

همچنین می توان از کیتوسان یا زغال چوب برای مراحل خالص سازی بیشتر فیکوسیانین استفاده کرد. اگرچه کیتوسان و زغال‌سنگ برای فرآیند خالص‌سازی مؤثر هستند، اما مسئول از بین رفتن مقادیر زیادی فیکوسیانین به دلیل جذب روی خود ماده هستند؛ به همین دلیل، کیتوسان و زغال چوب در حال حاضر خیلی مورد توجه قرار نگرفته اند.

منبع:

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/gc/c9gc03292d